成骨生长肽对体外培养奶牛成骨细胞增殖分化的影响

　成骨生长肽(osteogenic growth peptide，OGP)是近期发现的促成骨作用的多肽类生长因子。目前，已有很多学者用其在啮齿类哺乳动物上做过试验，证明该生长因子在加快骨折愈合、预防和治疗骨质疏松等方面有良好的效果。

    骨的形成是一个需要多种因子参与的非常复杂的生化反应过程。碱性磷酸酶(alkaline phospha-tase，ALP)是成骨细胞早期分化的标志，骨钙素(osteocalcin，OC)主要在矿化形成期出现，是成骨细胞成熟的标志，ALP及OC的表达程度可以反映骨的形成进程。

    本研究通过新生奶牛肋骨成骨细胞在体外的培养，初步探讨成骨生长肽对奶牛成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶影响，将有助于探索反刍类哺乳动物骨折愈合、骨病防治的新途径。

1  材料与方法

1．1  主要试剂和仪器

    骨钙素放免试剂盒(原子高科技股份有限公司)；DMEM高糖培养基(GIBCO公司)；新生小牛血清(武汉三利)；OGP(北京博奥森生物技术公司)；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(南京建成生物有限公司)；96孔板培养板(Coming公司)：酶联免疫检测仪(PERKINELMERHTS7000PLU)；倒置显微镜倒置相差显微镜(AE20)  (厦门麦克奥迪公司)；CO2培养箱[LAB(SL)水套式](美国SHEI公司)；超净工作台(KLC-3)  (哈东联)；精密计量天平(AE240)  (德国梅特勒公司)；紫外分光光度计(Spectrum 756pc)(上海光谱仪器有限公司)；离心机(L-5—A)(上海安亭科学仪器厂)；移液器(芬兰Labsytems公司)；其他试剂均为分析纯。

1．2  细胞来源与培养

1．2．1  原代培养

    无菌取新生奶牛肋骨5 cm，彻底去除骨膜及软组织；用无菌D-Hank’s液冲洗3次，剪碎至1 mm3体积大小；D-Hank，s液多次冲洗至骨片发白，放入锥形瓶内，加入0．25％胰蛋白酶(以覆盖为度)，37 度水浴中消化30min，去掉上清，重复消化4次。剩余骨片浸泡于培养液中，置37 度 CO2培养箱培养，此后2-3 d换液1次，倒置显微镜观察。

1．2．2  传代培养

    培养的细胞等到汇合长满培养瓶后就开始传代。将培养瓶中液体悉数倒掉后，无菌D-Hank’s液冲洗2次倒人0．25％胰蛋白酶约1 mL，以没过瓶的底壁为度，放人37 ℃培养箱中约5 min后取出置于倒置相差显微镜下观察，发现细胞间隙变宽、部分细胞变圆后即可用弯头吸管吹打培养瓶底壁，使胰蛋白酶将更多的贴壁细胞消化脱落下来，然后往培养瓶中加入约2 mL含20％胎牛血清的培养液终止胰蛋白酶的消化作用，再一次用吸管吹打瓶壁，使更多的贴壁细胞脱落下来。用吸管将吹打过的培养瓶内的液体移入到1 mL离心管中，在1 000 r/min的离心机上离心10min。离心后小心弃去上层3／4液体，再加入培养液至4mL，然后进行吹打。吹打后的液体用移液管移至2个培养瓶中，每瓶大约2 mL，然后置于倒置相差显微镜下观察细胞情况后放人37 度 5％C02饱和培养箱中培养，2—3 d换液1次。

1．3  成骨细胞鉴定

1．3．1  形态学观察

    从原代细胞起，每日使用倒置相差显微镜观察培养细胞的形态以及生长情况。

1．3．2  矿化结节染色定性

    细胞传到第二代后，使用培养皿进行培养，培养皿底部放置盖玻片，隔日换液，细胞培养20 d后将爬满细胞的盖玻片取出，采用茜素红法进行矿化结节染色。

1，4  细胞分组

    将第二代传代细胞分为7组。空白对照组：仅入含10％小牛血清的DMEM培养基；牛血清白蛋白试验组：含4％的牛血清白蛋白的DMEM培养基；试验组：在含10％牛血清、4％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM培养基中分别加入不同浓度的OGP(10(-12)，10(-11)，10(-10)，10(-9)和10(-8)moL／L)。所有试验中培养液隔日换1次。

1、5  细胞增殖的检测

1．5．1  成骨细胞增殖的检测

    采用噻唑蓝比色法即MTF法。将第三代传代细胞按每孔2X104／mL细胞密度接种于一块96孔细胞培养板中，按上述分组方案分为6组，每组设5个重复孔。在37℃5％CO：培养箱中预培养24h后，吸弃原培养液，换成每孑L100／μL无血清培养液，继续培养24h使各孔细胞同步化。弃去培养液之后往每孔加入200 μL含10％胎牛血清的不同浓度的OGP培养液(10(-11)，10(-10)，10(-9)，10(-8)和10(-7)mol／L)，隔日换液，于第5天取培养板弃原培养液，PBS液漂洗2次，每孔加入180μL新鲜DMEM培养液，再加入20μL MTT溶液(5 mg／mL)，于37℃孵育培养4—6h，细胞内出现深蓝色晶体后，终止培养，吸弃孔内上清液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min使细胞内结晶体完全溶解，直接于酶联免疫检测仪490nm波长处比色，测定各孔光吸收值(OD)，同时设置调零孔(培养基、MTF、二甲基亚砜)，每组设定3个重复孔。

1．5．2  成骨生长肽干预下成骨细胞生长曲线的测定

    方法如上。细胞培养换液同1．5．1，在第1，3，5，7天各取一块培养板，弃原培养液，PBS液漂洗2次，每孔加人1801xL新鲜DMEM培养液，再加人201xLMTF溶液(5mS／mL)，于37℃孵育培养4—6h，细胞内出现深蓝色晶体后，终止培养，吸弃孔内上清液，每孑Lin人150 ixL的DMSO，振荡10 min使细胞内结晶体完全溶解，直接于酶联免疫检测仪490 nm波长处比色，测定各孔光吸收值(OD)，同时设置调零孔(培养基、MIT、二甲基亚砜)，每组设定3个重复孔。

1．6  碱性磷酸酶的检测

    取第二代生长旺盛的成骨细胞经过消化后以含10％胎牛血清的DMEM液稀释，调节细胞悬液浓度为2X104／mL，以每孔200 1xL接种于96孔培养板，共设5个试验组及1个对照组，每组为6个平行孔，在37度5％CO2培养箱中预培养24h后，吸弃原培养液，换成每孔100μL无血清培养液，继续培养24h使各孔细胞同步化。弃去培养液之后，试验组往每孔加入200μL含10％胎牛血清的不同浓度的OGP培养液(10(-12)，10(-11)，10(-10)，10(-9)和10(-8) mol／L)，隔日换液，5d后收集上清液，取0．1mL用氨基安替比林测酚法测定ALP的活性。

2  结果

2．1  奶牛成骨细胞鉴定

2．1．1  形态学观察

    倒置相差显微镜观察原代培养的细胞在接种7d左右可见部分细胞贴壁，伸展呈现三角形、星形、短梭形或纺锤形等多种形态，10 d左右形态相似的细胞成堆出现。细胞胞浆向外伸展出2-4个突起，有的突起已相互连接。培养14 d后细胞融合为单层，细胞形态多为单核、多边形及长梭形，胞突相互连接，呈“铺路石”样排列(图1)，20 d后细胞重叠生长(图2)，这些表现均符合成骨细胞的形态特征。

 

2．1．2  矿化结节染色定性

    培养细胞18 d后，茜素红染色显微镜下呈现大小、形态不一的洋红色阳性结节(图3)。


2，2  OGP对成骨细胞增殖活性的影响

    表1为第5天检测的结果；10(-12)-10(-8)moL／L浓度范围的OGP均能促进成骨细胞的增殖，并且呈现剂量依赖方式，与对照组相比，10(-12)moL／L试验组即可促进成骨细胞增殖，与对照组比较差异不显著(P>0．05)，10(-11)-10(-8)mol／L试验组与对照组比较均有极显著差异(P<0．01)，以10(-10)moL／L试验组差异最为显著(P<0．01)，在10(-9)mol／L试验组时吸光度值开始下降。 

 
    图4是第1，3，5，7天各取一板做的MTF从而绘制的加入OGP后的成骨细胞的生长曲线。从图中可以清楚地看到在第1，3，5，7天均能促进成骨细胞的增殖，并且呈现时间依赖方式，以第5天增殖最为明显，第7天吸光度值开始下降。 

 
2．3  OGP对细胞上清液中ALP活性的影响

    试验结果显示：不同浓度OGP培养5 d后，ALP活性均呈不同程度减少，其中10(-10)mol／L试验组与对照组比较差异极显著(P<0．01)。而且在达到最低值后随着浓度的增加，ALP活性略有增强。如表2所示。 

 
3  讨论

    成骨生长肽是新近被发现的具有促进成骨和刺激造血的多肽类生长因子，自Bab等首先报道了愈合的骨髓组织能产生促进成骨细胞增殖的活性因子，通过进一步的分离纯化，得到一个14个氨基酸组成的多肽即OGP以来，很多学者对其进行了深入的研究。现已明确，OGP主要存在于正常人和哺乳动物的血清中，它由成骨细胞产生并作用于成骨细胞，维持成骨细胞的正常骨代谢。本研究基于前人未曾对反刍类哺乳动物进行过细胞水平的实验研究，想通过对其在奶牛成骨细胞体外培养中对碱性磷酸酶和骨钙素的影响，探讨成骨生长肽在反刍类动物上对刺激骨形成的作用机理。

    本试验通过MTY法证实了加入成骨生长肽的试验组成骨细胞增殖量明显高于对照组，其最佳促成骨细胞增殖的OGP浓度为10(-9) mol／L。这一浓度同饶寒敏等报道的一致，同Gabarin等报道的10(-11)mol／L不同，这可能与OGP的来源及处理方法、动物种类、细胞来源和培养条件不同有关。本试验培养的细胞是新生奶牛的肋骨，此细胞周期同饶寒敏等试验用细胞增值周期有所不同，试验所用OGP为北京博奥森公司生产，纯度为95％，蛋白含量为74％。OGP的配制方法参考饶寒敏等报道的处理方法以确保OGP的活性。王晓峰研究中发现一个现象，未加入OGP的细胞组加入OGP抗体后细胞增殖也有部分抑制，细胞膜上OGP表达也降低，说明在细胞增殖过程中，OGP可能是一个原本就存在的调控因子。本试验虽然证实了加入成骨生长肽的试验组细胞增殖明显，但是OGP对奶牛成骨细胞增殖的作用机理、参与增殖活动的相关因子，仍需做进一步深入的研究。

    本研究中采用MTT比色分析法测定细胞的增殖，能准确、灵敏地反映OGP对成骨细胞增殖的影响，进而反映药物对骨代谢的影响。不同时间对培养的细胞进行MTF检测有助于了解培养细胞的增殖情况和影响因素。此方法不受外界干扰，速度快、精度高、结果稳定，已经广泛应用于药物及生长因子等对细胞增殖影响的研究。在本试验中，正式试验前，细胞先用无血清培养基培养24h，目的是使细胞回复到Go期，保证大多数细胞在给药前处于同一细胞分裂相，既排除了细胞分化状态不同而可能引起的增殖差异，又排除了胎牛血清中复杂成分可能对结果所产生的影响。

    碱性磷酸酶是成骨细胞成熟分化的标志，它反映了成骨细胞活跃，是成骨细胞的催化剂，促进骨基质的矿化。本研究中试验组碱性磷酸酶的活性反而低于对照组，这与徐凌等报道的结果相反。推测可能是因为成骨细胞内含有大量的骨性碱性磷酸酶，当成骨细胞转化为骨细胞时，骨性碱性磷酸酶活性逐渐下降、消失；亦有可能是培养基中BSA的浓度过大，导致细胞提前达到分化的时间；亦可能是因为动物种属不同而异。