牛体外受精胚胎培养技术研究

在COCs体外培养过程中添加共培养物质和采用不同体积的液滴进行培养，以探讨牛卵母细胞的体外培养效果。结果表明，卵丘细胞、卵丘细胞+bPF共培养系统对胚胎发育均有促进作用，其中以卵丘细胞+bPF共培养系统对桑椹胚和囊胚的发育最好，其囊胚率为10．63％，显著高于对照组的7．23％(<《0．05)，高于卵丘细胞组的8．50％(P，0．05)。用培养皿微滴培养(50ul)和用4孑L板大体积培养(500ul)的试验表明，大体积培养比微滴培养有优势，桑椹胚和囊胚率均较高，其中囊胚率为10．23％，显著高于培养皿微滴培养的9．07％(P<0．01)。 

    早期胚胎的体外培养是体外受精、动物克隆、转基因等生物技术的一个关键环节，尽管体外培养许多物种的胚胎均可发育到囊胚阶段，但囊胚率偏低、质量较差，主要原因是胚胎体外培养系统不完善、体外胚发育能力差，移植后妊娠率降低。目前胚胎的体外培养系统不能完全模拟母畜生殖道内的环境，且不稳定。建立一个简单、稳定的胚胎发育培养系统势在必行。

    本试验采用不同的培养系统对牛体外受精胚胎进行了体外培养，研究了不同培养条件下胚胎的体外发育能力，优化了牛胚胎体外培养系统。

1  材料与方法

1．1  主要试剂和设备

    主要试剂有促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、17B·雌二醇(17p—E：)、胎牛血清(PDS)、牛血清白蛋白(BSA)、199培养基(TCMl99)、表皮生长因子(EGF)、羟乙基哌嗪乙烷磺酸(Hepes)、谷氨酰胺(Gin)、咖啡因、肝素钠等。

    主要仪器有体视镜、CO2培养箱、超净工作台、电子天平、台式离心机等。

1．2  牛卵泡卵母细胞的采集与成熟培养

    试验用卵巢采自甘肃省平凉市崆峒区屠宰场。将采集的卵巢处理好后，抽取卵巢表面直径为2—8 mm卵泡中的卵母细胞，于体视镜下检卵，挑选卵丘细胞完整致密、胞质均一、色泽浅的A、B级COCs成熟培养。COCs用洗卵液洗涤3—5次，然后用IVC液洗涤3—5次。在培养皿或四孑L培养板(50ul或500ul培养液)中培养24h，培养时用石蜡油覆盖，每个微滴内培养10—40个COCs。培养条件为5％C02，38．5℃和饱和湿度。IVC液预先在培养箱中平衡2 h。

1．3  卵母细胞体外成熟的判断

    卵母细胞成熟培养一定时间后，观察卵母细胞周围的卵丘细胞扩展情况、胞质均一性，并抽检卵母细胞第一极体排出情况。以卵丘细胞扩张、第一极体排出作为卵母细胞体外成熟的标志。

1．4  卵母细胞体外受精

    精液为上海金晖公司0．25 mL南德温牛(SD)冻精，编号以实际使用时记录为准。

    将成熟培养24 h、卵丘细胞充分扩展成熟A、B级COCs用受精液充分洗涤3遍，然后按每微滴(501xL或500ul)10～40枚(依成熟卵母细胞数确定)移入己平衡2h以上、有石蜡油覆盖的受精液中，再加入等体积的经浓度调整的获能精液，置CO2培养箱中孵育8 h。受精结束后，震荡去除卵母细胞外围的精子和卵丘细胞，受精卵继续进行胚胎培养。

1．5  胚胎培养

    受精结束后，将受精卵移出受精滴，用IVC液充分洗涤3次，移人已平衡2h以上的盛有胚胎培养液4孔培养板或培养皿中。培养液覆盖石蜡油，每次培养受精卵10-40枚，每隔48 h半量更换培养液。受精后48 h统计卵裂率并吸弃未分裂的卵母细胞，继续培养120h，定期观察早期胚胎发育情况。

1．6  培养基配方

    检卵液和IVM液以TCMl99为基础配制，精液清洗液和精子获能液(卵母受精液)以BO液为基础配制。

    IVC液：TCMl99+10％FBS+Gin 0．1 mS／mL+EGFlug／mL十卵丘细胞共培养系统。

1．7  共培养系统

1．7．1  卵丘细胞的制备

    把采集COCs时弃去的上清卵泡液移人另一10mL玻璃离心管，在培养箱静置一会儿后吸取上方2mL清亮卵泡液，加入到盛有2mL0．2％的透明质酸酶的离心管中，摇匀，静置5 min，然后用手振荡1min，再加入约2mL洗卵液，立即1 500r/min离心5min，弃去上清液；再加入5 mL IVC液，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液；给沉淀物(卵丘细胞)加入适量的IVC液，稀释成l X10个／mL，待卵丘细胞扩散后，吸弃大块的凝聚物。最后将卵丘细胞液滴放入CO2培养箱培养24h，备用。

1．7．2  大卵泡液的制备

    用注射器从牛卵巢表面中等大小卵泡中抽取卵泡液，然后注入于离心管，经3 500r／min离心15 min。取上清液，0．22um滤器过滤除菌，分装冷冻保存备用。用前解冻并加入成熟液中。

1．8  试验设计

1．8．1  共培养系统对胚胎发育的影响

    用IVC液培养卵丘细胞(1．0X10)个／mL)，24h后用作共培养系统，每次用量为50 ul。bFF按照添加量也为50 ul。培养滴体积为500ul。用前2hCO：培养箱平衡。培养方法：用共培养系统中培养受精卵，48 h后镜检，计算卵裂率。50％换液，继续培养120h，计算桑囊胚率。

1．8．2  培养液体积对胚发育的影响

    分别用50uL和500／uL培养液培养胚胎，培养48 h后按照50％换液，继续培养120h，观察并记录桑囊胚发育情况。均按照10％添加卵丘细胞和bFF。

1．9  数据处理

全部数据均用SPSSl3．0统计分析。

2  结果

2．1  共培养系统对胚胎发育的影响

2．1．1  共培养系统对桑椹胚发育的影响

卵母细胞体外胚的发育培养受到多种因素的影响，其中培养液的组成成分尤其重要。培养过程中应尽量模拟卵母细胞或胚胎在子宫中的条件，给细胞发育创造良好的环境。许多报道表明，卵母细胞体外受精过程中明显存在2细胞发育阻滞现象，克服2细胞发育阻滞的主要手段就是用共培养系统提高卵裂率和桑囊胚的发育率。本试验在IVC基础培养液中添加卵丘细胞(1．0 X 10个／mL，10％)、卵丘细胞+bFF(各10％)，与对照组进行了比较。各项测定结果及统计分析详见表1。

    统计分析表明，共培养系统对卵母细胞体外胚的发育具有促进作用。在本试验选取的2种共培养系统中，卵丘细胞+bFF组的桑椹胚率达到34．99％，显著高于卵丘细胞组的29．07％(P<0．05)和对照组的26．67％(P<0．01)，卵丘细胞组虽然高于对照组，但差异不显著(P>0．05)。

2．1．2  共培养系统对囊胚发育的影响

对共培养条件下检出的桑椹胚继续培育，检测囊胚的发育情况。结果统计见表2。卵丘细胞+bFF组的囊胚率达到10．63％，显著高于对照组的7．23％(P<0．05)，但与卵丘细胞组的8．50％差异不显著(P>0．05)。卵丘细胞组略高于对照组，差异也不显著(P>0．05)。上述统计分析表明，共培养系统对卵母细胞囊胚发育有促进作用，其中卵丘细胞+bFF组成的共培养系统对囊胚的发育率比较好。 

 
2．2  培养液体积对卵母细胞胚胎发育的影响

2．2．1  培养液体积对桑椹胚发育的影响

培养液的体积与卵母细胞的成熟、卵裂及进一步的发育密切相关。常用方法为微滴培育，微滴体积控制在50-100 uL之间，近年又有将培养液体积扩大到200—500 ul的报道。因此，本试验选择了50ul和500 ul 2种培养液培育方式，以对不同培养液体积做出选择。不同培养液体积对桑椹胚发育效果的测定结果见表3。

    表3资料表明，培养液体积不同，桑椹胚发育状况也不同。500 ul培养液的桑椹胚率为36．23％，显著高于50 ul的33．14％(P<0．01)。

2．2．2  培养液体积对囊胚发育的影响

在桑椹胚培养的基础上，进一步测定囊胚的发育情况。试验表明(表4)，50 ul和500ul2种培育方式的囊胚发育趋势与桑椹胚发育一致，培养液体积不同，囊胚发育状况不同。500ul培养液的囊胚率为10．23％，显著高于50 ul的9．07％(P<0．01)。
3  讨论

 构成卵母细胞体外胚胎共培养系统的主要有卵丘细胞、卵泡液、输卵管上皮细胞、EGF等因子等，它们在培养液中加入的比例和共培养时间均可对胚胎发育产生不同程度的影响。本试验中采用了卵丘细胞和卵泡液作为胚胎发育的共培养系统。卵丘细胞是包被在卵母细胞周围的多层颗粒样细胞组织，它与卵丘细胞结合形成COCs。排卵之前，卵丘细胞扩展，合成大量胞外基质，富含透明质酸(HA)，有利于排卵后进入输卵管，也保证了卵母细胞正常的受精和胚胎发育潜力。卵丘细胞和卵母细胞通过裂隙密切联接，卵丘细胞能够吸收卵泡液中的低分子物质，经代谢转化，通过细胞连接为卵母细胞的生长提供物质和能量；卵母细胞在生长过程中释放卵丘细胞生长促进因子‘2)，刺激透明质酸酶合成，调节卵丘扩散，卵母细胞生发泡破裂逐渐进入MI期，卵丘细胞可以启动卵母细胞内的蛋白质合成，大量蛋白质合成可激活成熟促进因子(MPF)，促进卵母细胞成熟。卵母细胞与卵丘细胞结合的紧密程度、卵丘细胞群的完整度直接影响体外成熟的效果。卵丘细胞对卵母细胞体外成熟的影响与其浓度有关，在促性腺激素或发情牛血清存在的情况下，低浓度的卵丘细胞(0．5 X10—5X10个／mL)能够刺激卵母细胞成熟分裂的启始；高浓度(50X10-100X10个／mL)的卵丘细胞抑制卵母细胞成熟分裂的复始。卵丘细胞对精子有筛选作用，COOs成熟受精后的桑椹胚、囊胚发育率显著高于裸卵。卵丘细胞能诱发精子发生顶体反应，并增加其穿透能力。因此，在培养液中添加卵丘细胞，可促进卵母细胞体外成熟、体外受精和早期。

    卵泡液(bPF)是卵母细胞成熟的介质，含有多种生长因子、微量元素，蛋白质等大量生化因子和来自卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子。卵泡液对卵母细胞成熟的影响主要与卵泡液中的生化组分有关，卵泡大小不同，卵泡液成分也不同。卵泡液中含有硫氧还原蛋白过氧化酶、甲状腺运载蛋白和视黄醇结合蛋白，这些蛋白质在卵泡发生时开始产生，对卵泡发育和卵母细胞成熟有明显促进作用。马卵母细胞在100％的卵泡液中成熟后，受精率显著高于无卵泡液和20％卵泡液成熟组。水牛卵泡越大，卵母细胞发育率和受精率就越高，胚胎发育潜力也越大。石德顺等报道在卵母细胞成熟培养液中添加适量(10％—20％)的卵泡液可以提高卵母细胞的受精率和囊胚发育率，但当添加的卵泡液浓度过高时则抑制了卵母细胞的核质成熟，说明卵泡液的浓度与卵母细胞核质成熟密切相关。卵母细胞在添加小卵泡卵泡液的成熟液内培养，体外受精后其桑椹胚和囊胚的发育率明显低于添加大卵泡液成熟的卵母细胞，说明小卵泡卵泡液对牛卵母细胞体外发育有抑制作用。卵泡液中含有抑制成熟因子，张明觉等发现兔子的卵泡液抑制成熟分裂，随后发现在地鼠、大鼠、小鼠和猪等动物上也有此现象。

    本试验从卵丘细胞、卵丘细胞+bFF二方面探讨了共培养系统对桑椹胚和囊胚发育率的影响，结果表明，单一卵丘细胞共培养系统(1．0 x10个／mL，10％)对胚胎发育有一定的促进作用，可显著促进桑囊胚的发育，但其效果比卵丘细胞+bFF组成的共培养系统(各10％)差，说明bFF也可促进胚胎发育，并与卵丘细胞有协同作用，共同促进了胚胎发育。

    常用的培养液体积为50uL的微滴，每个微滴可培养卵母细胞或胚胎5-20枚不等，但由于体积过小，操作难度较大。近期已有用大液滴培养卵母细胞和胚胎的报道，液滴体积在0．1—0．5 mL。

    培养液体积与液体蒸发、培养系统的稳定有关。培养液量过小，胚胎培养微环境平衡性差，培养环境容易随外围环境改变；而培养液量过大，胚胎及细胞分泌的生长因子浓度降低，不能有效促进胚胎正常发育。Pereira在胚胎培养系统中，观察单个胚胎培养与群体培养，发现群体培养胚胎质量更佳，可能与提高了胚胎分泌因子浓度有关。另外，现在多用4孔培养板，比以前使用的小培养皿的效率高，为大体积培养创造了良好条件。

    本试验采用了2种不同体积的培养液进行胚胎培养，试验结果表明，500ul大体积培养液的胚胎发育效果显著优于50 ul。因此，在本试验条件下，500 uL体积的培养液有利于牛胚胎的培养。

4  小结

    本试验采用卵丘细胞、卵丘细胞十bFF共培养系统对胚胎进行了发育培养，结果表明2种共培养系统均对桑椹胚和囊胚的发育有促进作用，其中以卵丘细胞+bFF共培养系统对桑椹胚和囊胚的发育最好。因此，共培养系统是促进胚胎发育到桑椹胚和囊胚阶段的有效方法。

    用培养皿微滴培养(50uL)和用4孔板大体积培养(500 ul)的试验表明，大体积培养比微滴培养有优势，桑椹胚和囊胚率均较高。