氟喹诺酮类药物体外抗ASFV活性研究

　　摘要：

　　非洲猪瘟是重要的猪传染性疾病，目前尚无针对非洲猪瘟的有效疫苗，也没有合适的处置措施。本研究发现氟喹诺酮类药物具有抗非洲猪瘟的活性。当将非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)早期感染的vero细胞暴露于6种不同的氟喹诺酮类药物或他们的组合时，可以发现ASFV所导致的vero细胞的病变效应大幅的下降。此外，经过7天的药物处理，甚至无法通过PCR手段检出ASFV的核酸，而且培养液的上清不能感染新的细胞培养物。脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析发现经氟喹诺酮类药物处理后，细胞中病毒DNA的量有所下降，但是并未检测到病毒基因组碎片。在平行组中还发现病毒早期蛋白合成模式有所变化。本研究试验结果说明，细菌的拓扑异构酶抑制剂可能通过抑制假定的ASFV的2型拓扑异构酶来抑制ASFV的复制，这一研究结果为非洲猪瘟的治疗开辟了新的路径。

　　1. 简介

　　非洲猪瘟是一种严重威胁养猪业的疾病。非洲猪瘟在撒哈拉以南非洲国家是一种地方性流行病，该病于2007年又经格鲁吉亚传入欧洲大陆。从那时起，非洲猪瘟就不断的传播至邻近的国家或地区，从而彻底的改变了欧洲的非洲猪瘟形势。除了已感染非洲猪瘟的国家和地区以外，其他欧盟国家因与感染非瘟的国家地理位置较近的缘故，所以也是非瘟高风险地带。俄罗斯联邦及其周边地区非洲猪瘟由于缺乏统一的控制方案，大量的没有生物安全意识的散养户的存在，以及用泔水喂猪的方式，导致了对非洲猪瘟的控制困难重重。

　　在这种形势下，欧盟的非洲猪瘟也时刻存在着传入东欧的风险，尤其是通过一些较难控制的途径，比如野猪的迁移、动物或动物产品的非法调运、受污染的传播媒介等。尽管已经投入了大量的时间和精力，但目前仍然没有研制出一种可以控制非洲猪瘟的疫苗产品，而且非洲猪瘟的控制需要做到早期诊断和极为严格的生物安全措施，所以非洲猪瘟往往会给感染的国家带来很大的经济损失和社会危害。

　　非洲猪瘟的病原非洲猪瘟病毒是一种大DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科的唯一一个成员。非洲猪瘟病毒可以编码2型拓扑异构酶(ASFV-TopoII)，这一点相比于其他可感染哺乳动物的病毒而言是十分独特的。进化树分析表明，ASFV-TopoII与宿主细胞的TopoII不在同一进化分支，并且还与细菌DNA回旋酶和4型拓扑异构酶有25%区域完全一致，由此人们想到通过细菌的拓扑异构酶抑制剂(如氟喹诺酮类)来干扰ASFV的复制。

　　氟喹诺酮类药物具有抗菌活性，因为氟喹诺酮类药物可以与细菌DNA回旋酶和4型拓扑异构酶形成药-酶-DNA裂解复合物，从而干扰DNA的复制和促发细胞死亡(如氧化应激和基因组断裂)。DNA回旋酶在DNA解链中发挥很大的作用，而4型拓扑异构酶在基因组分解过程中发挥很大的作用。

　　近期的研究发现氟喹诺酮类药物分子结构所起的化学修饰作用是其“非典型”的抗病毒(RNA病毒或者DNA病毒)作用的物质基础。考虑到ASFV可以编码2型拓扑异构酶，我们要通过试验来分析这些抗生素是否对ASFV的DNA复制和蛋白质合成有抑制活性，本试验用到的病毒株为Ba71V毒株，用到的培养细胞为Vero细胞。由于现在还没有合适的非洲猪瘟疫苗以及有效的防控措施，如果能发现一种有效的抗病毒药物，再将这种药物用于非洲猪瘟的防控，那么对于预防非洲猪瘟的扩散必将发挥很大的作用，也可以为政府机构采取干预措施赢得时间。

　　2. 材料和方法(略)

　　3. 结果

　　3.1 感染了ASFV的Vero细胞培养于含特定氟喹诺酮类药物培养基中，ASFV的细胞病变减轻

　　ASFV在感染进程中会伴随有明显的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)、细胞凋亡和细胞死亡，本研究最开始评估30种氟喹诺酮类药物的抗病毒性质时，就是参考的Vero细胞的CPE这一指标。一部分氟喹诺酮类药物(恩诺沙星、格帕沙星、巴洛沙星、托氟沙星、加替沙星和加洛沙星)被证实在100μg/ml浓度时有抗病毒效应。被感染过的培养物在4小时后暴露于这些药物7d时间后，其CPE会变小甚至消失，当在感染后72小时与未经处理的ASFV感染的Vero细胞作比较的时候，会发现经药物处理组细胞接近于正常未感染的细胞。处理组感染ASFV的细胞会见到核碎裂所致细胞起泡，而不是典型的CPE现象。经药物处理组大部分的细胞单层保持着典型的纤维素样形态，而未经处理的细胞则表现出清晰的CPE现象，其质/核比例因此下降，如图1a和图1b。